Árticulos | NTHE

NTHE número 31


Generación de un sistema de expresión del gen GCaMP6s en la especie Danio rerio
Pablo Emiliano Backhoff García1
Dr. Luis Roberto Rodríguez Ortiz (asesor)2
1 emiliano.backhoff@gmail.com; 2 rodriguez.ortiz.lr@gmail.com
1 Universidad Autónoma de Querétaro
2 CONACYT-Instituto de Neurobiología, UNAM Juriquilla
Querétaro, México


Resumen
El pez cebra es un modelo biológico muy utilizado en los campos de la investigación biomédica, genética y metabólica, entre otras. Para la presente investigación, utilizando el sistema Tol2, se buscó construir un plásmido de expresión ubicua para el gen sensible al calcio GCaMP6s. De tres plásmidos posibles (p5E_h2afx, p_CMV y p_βactin), se modeló el sistema pDestTol2-pCMV-GCaMP6s por medio de SnapGene y se construyó por restricción enzimática y ligación catalizada por T4. Los fragmentos genéticos y vectores construidos se caracterizaron por fragmentos de restricción por electroforesis en 1% de geles de agarosa y PCR en colonia. A los embriones de pez, durante su estado unicelular embrionario, se les microinyectaron dos sistemas de expresión; el Mix 1 (pDestTol2-ph2afx-GCaMP6s) y el Mix 2 (pDestTol2-pELAVL3-GCaMP6s). Tres días después de la fertilización, se observó la expresión de GCaMP6s. Solo las larvas microinyectadas con el Mix 2 expresaron el gen. Los sistemas con promotores CMV y h2afx no se construyeron exitosamente.

Palabras clave
sistema Tol2, GCaMP6s, microinyección, PCR en colonia, clonación por restricción

Abstract
Zebrafish is a biological model widely used in the fields of biomedical, genetic and metabolic research, among others. With the use of the Tol2 system, we sought to construct a ubiquitous expression plasmid for the calcium-sensitive GCaMP6s gene. From three possible plasmids (p5E_h2afx, p_CMV and p_βactin), the pDestTol2-pCMV-GCaMP6s system was modeled via SnapGene and was constructed by enzymatic restriction and ligation catalyzed by T4. The genetic fragments and constructed vectors were characterized by restriction fragments by electrophoresis in 1% agarose gels and PCR in colony. Fish embryos, during their unicellular embryonic state, were injected with two expression systems; Mix 1 (pDestTol2-ph2afx-GCaMP6s) and Mix 2 (pDestTol2-pELAVL3-GCaMP6s). GCaMP6s expression was observed three days after fertilization. Only micro larvae injected with Mix 2 expressed the gene. CMV and h2afx promoter systems were not built successfully.

Keywords
Tol2 system, GCaMP6s, microinjection, in colony PCR, restriction cloning